Het koppelt op een specifieke plaats aan een DNA- of RNA-keten en vouwt zich er omheen. Vervolgens ontwindt het het DNA of RNA en ritst als het ware de dubbelspiraal open. Daardoor wordt een stukje in de enkelstrengs-vorm tijdelijk toegankelijk voor andere actieve componenten van het enzym.

Vervolgens worden steeds nieuwe nucleotiden (basen) aan de te vormen RNA-streng gekoppeld. Welk nucleotide dit zal zijn wordt steeds bepaald door de tegenoverliggende DNA of RNA nucleotide. Het DNA of RNA fungeert dus als een 'mal' (men spreekt van template). Het RNA polymerase beweegt zich in de zogenaamde 3' → 5' richting over het DNA of RNA, waarbij de nieuwe RNA-keten in de 5' → 3' richting wordt gesynthetiseerd. Tegelijkertijd wordt het RNA aan de achterkant weer gescheiden van het DNA of RNA. Wanneer het hele gen gekopieerd is, koppelt het RNA polymerase los van het DNA of RNA en wordt tevens de nieuwe RNA-keten afgestoten.

Na verdade existem três tipos de RNA polimerases nos eucariotas: RNA-polimerase I, que auxilia na formação de de rRNA (RNA ribossomal), a RNA-polimerase II, que sintetiza o mRNA citoplasmático e por fim a RNA-polimerase III que sintetiza pequenos rRNA e tRNA. Nos procariotas existe apenas um tipo de RNA polimerase que é capaz de sintetizar qualquer um dos tipos de RNA.